Prospects and Applications of Innovated Quantitative Fluorescent PCR (IQFPCR) in Analyses of Genetic Mosaics Using Gonosomal Sequences

Možnosti a využití inovované kvantitativnífluorescenční PCR (IQFPCR) v analýze genetickéhomozaicizmu pomocí gonozomálních sekvencí

Východisko.
Kvantifikace fluorescenčně značených PCR produktů na kapilární elektroforéze (QF PCR) má svélimity především v citlivějších analýzách, ve kterých je potřebné zachytit minoritní buněčnou linii a rozpoznat malézměny v závislosti na čase. V těchto případech může být chyba měření a reprodukovatelnost výsledků velmiovlivněna hlavně lidským faktorem a efektivitou PCR. Hlavním cílem studie bylo posoudit a optimalizovat kvantitativnímožnosti inovované QF PCR s přímou návazností na kvantifikaci Y sekvencí u gonozomálních mozaik.Metody a výsledky. Arteficiálně vytvořené Y/X DNA mozaiky byly testovány a kvantifikovány inovovanou QFPCR, která nahrazuje a rozšiřuje real-time PCR.Na základě porovnání intenzity fluorescence PCR produktů po jednotlivých cyklech byly sestrojeny grafy nárůstufluorescence pro různá ředění. Analýzou podílu signálu vnitřní kontroly a příslušné mozaiky byla sestrojenakalibrační křivka pro kvantifikaci Y sekvencí. Pro výpočet vzácných mozaik byl sestaven empirický vzorec.Závěry. Rozšíření QF PCR o manuální real-time PCR eliminuje meze QF PCR a zpřesňuje kvantifikační analýzyzaložené na PCR. Novelizovaný DNA diagnostický přístup – IQF PCR, který se vyznačuje vysokou citlivostía přesností, umožňuje významný posun v analýze gonozomálních Y/X mozaik.

Klíčová slova:
gonozomální mozaicizmus, kapilární elektroforéza, kvantifikace DNA, real-time PCR, QF PCR.